Năm 1539, đứa con được chọn để thừa kế bởi vua John III là hoàng tử João Manuel của Bồ Đào Nha, người mà dự định sẽ là hôn phu của Joanna của Áo, Công chúa Bồ Đào Nha. Nhưng đứa con này của ông chết 18 ngày chỉ trước ngày ra đời của Sebastian vào ngày 20 tháng 1, 1554 vì bệnh đái tháo đường vị thành niên. Khi ông chết vì phong vào năm 1557, đứa con trai Sebastian, người sẽ kế thừa hoàng vị của ông, mới được có 3 tuổi. Ti hài của ông được an táng tại Tu viện Jerónimos, Lisbon.